［摘要］目的：研究不同光质对灵芝菌丝体生长及抗氧化酶活性的影响，为灵芝菌丝体培养提供科学的理论依据。方法：采用新型半导体发光二极管（LED）光源设置不同光质处理，动态观测灵芝菌丝体生长、多糖含量及抗氧化酶活性变化。结果：蓝光处理及黑暗对照条件下灵芝菌丝体生长较快，黑暗对照条件下菌丝体形态纤细、菌落淡薄，蓝光、白光处理菌丝体粗壮、菌落浓密。白光处理菌丝体生物量积累最高，蓝光次之。绿光处理灵芝菌丝体POD酶活性波动变化较大，生长中后期显著高于其他处理。白光处理菌丝体CAT酶在生长过程中始终保持较高活性。生长前期黄光处理菌丝体SOD酶活性最高，后期黑暗对照SOD酶活性较高。前期绿光处理菌丝体多糖含量较高，生长后期蓝光处理菌丝体多糖含量显著高于其他处理。结论：光质影响灵芝菌丝体生长代谢，蓝光利于灵芝菌丝体生长代谢。
［关键词］灵芝；光质；发光二极管；生长；抗氧化酶活性；灵芝多糖
光作为重要的环境因子，通过光强、光周期和光质影响生物生存与发展。光质即不同波长光谱成分［1］。近年来，国内外有关光质的研究已成为热点［2-3］，但关于真菌方面研究报道较少。
灵芝Ganodermalucidum属担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、灵芝属真菌，在我国有2000多年药用历史，其子实体、孢子、菌丝体均可入药［4］。传统上灵芝菌丝体在黑暗条件下培养，本文选用光质纯、光效高、波长固定、发热低［5］的发光二极管（LED）光源设置光质条件，研究不同光质处理灵芝菌丝体生长及抗氧化酶活性差异，为灵芝菌丝体培养提供理论依据。
1材料
供试菌株S3灵芝菌株，由中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所生物发酵实验室提供，该菌株经太空搭载，具有优质高产特性和稳定遗传性。
2方法
2.1光质选择及处理条件
LED光源购自淄博曙光科技公司，功率24W，分为红光R、蓝光B、黄光Y、绿光G及白光W5个处理，设黑暗为对照。不同光质波长采用美国产ASDFieldSpecHandHeld光谱分析仪测定。培养架高度一致，光源均匀分布于顶部，外层由黑色遮光材料覆盖。
2.2培养基及培养条件
2.2.1供试培养基 ①母种培养基：保藏母种采用PDA培养基。②实验培养基：每1L水中加入麸皮50g（煮后滤汁）；葡萄糖20g；马铃薯100g（煮后滤汁）；琼脂粉16g；VitB120mg；MgSO4·7H2O1.5g；KH2PO43g，pH约7.0。
2.2.2培养条件 超净工作台下，将实验培养基定量装入直径12cm的培养皿中，装液量50mL。凝固后，接入菌龄一致直径1cm的圆形母种菌块。不同光质处理培养12d，培养温度25℃。
2.3灵芝菌丝体生长速度及生物量测定
2.3.1生长速度观测 培养后第4天起，不同光质处理随机取样，采用十字交叉法每1d测定1次菌落直径并观察各处理菌落形态至第12天结束，每个处理重复3次。
2.3.2生物量测定 培养后第6天起，不同光质处理随机取样，采用烘干恒重法每2d测其生物量1次至第12天结束，每个处理重复3次。
2.4 灵芝菌丝体POD，CAT，SOD酶活性
测定培养后第6天起，不同光质处理每2d随机取样1次。至第12天结束，分别测其POD，CAT，SOD酶活性。
2.4.1POD酶活性测定 准确称取鲜重样品0.1g，加入3mLPBS缓冲液（pH6.0）冰浴研磨，于4℃下10000r·min－1离心15min，取上清液即酶提取液，采用“愈创木酚法”［6］测定其POD酶活，每个处理重复3次。
2.4.2CAT酶活性测定 准确称取鲜重样品0.1g，加入3mLPBS缓冲液（pH7.8）冰浴研磨，于4℃下8000r·min－1离心15min，取上清液即酶提取液，采用Cakmark方法［7］测定其CAT酶活，每个处理重复3次。
2.4.3SOD酶活性测定 准确称取鲜重样品0.1g，加入3mLTris缓冲液（pH8.2）冰浴研磨，于4℃下4000r·min－1离心15min，取上清液即酶提取液，采用“邻苯三酚自氧化法”［8］测定其SOD酶活，每个处理重复3次。
2.5灵芝菌丝体多糖含量测定
培养后第6天起至第12天结束，不同光质处理每2d随机取样1次，于60℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛，作为测定菌丝体多糖含量样品。精确称取样品0.1g加入10mL无水乙醇，60℃恒温水浴30min。过滤取滤渣，加入20mL蒸馏水，95℃恒温水浴振荡提取2h，过滤，取滤液定容至25mL，得待测样品溶液。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=5.832X－0.0328（R2=0.9941）。采用苯酚-硫酸法［9］对各处理样品多糖含量进行测定，每个处理重复3次。
2.6数据分析
采用SPSS17.0统计软件对实验数据进行统计分析。Duncan新复极差法比较各处理间及处理与对照间差异。
3结果与分析
3.1LED光质对灵芝菌丝体生长影响
黑暗对照条件下灵芝菌丝体前期生长较快，后期生长速度明显下降。培养后第9天黑暗对照和蓝光处理灵芝菌丝体长满培养皿，菌落直径达12cm。绿光处理菌丝体生长最慢，至第9天菌落直径仅9.12cm。菌落形态方面，黑暗对照条件下菌落生长淡薄，菌丝纤细呈螺旋状。蓝光、白光处理菌落生长浓密，菌丝呈匍匐状。红光处理菌落轮纹状生长，菌丝呈绒毛状，见图1。
3.2LED光质对灵芝菌丝体生物量积累影响
灵芝菌丝体生长过程中生物量积累呈“S”形变化，前期积累较快，中期积累速度放缓，后期有所升高。白光处理灵芝菌丝体在整个生长过程中生物量始终保持最高，蓝光处理次之。黄光、绿光处理菌丝体在生长中期生物量积累较高，后期积累速度下降明显，见图2。
3.3LED光质对灵芝菌丝体抗氧化酶活性影响
3.3.1对POD酶活性影响 不同LED光质处理灵芝菌丝体POD酶活性总体表现先升后降趋势。培养至第8天红光、黄光、绿光及黑暗对照条件下POD酶活性均达到最大值。绿光处理灵芝菌丝体POD酶活性变化较大，第6天绿光处理菌丝体POD酶活性显著低于其他处理，第8天和第10天其POD酶活性显著高于其他处理。黑暗对照条件下菌丝体在整个生长过程中POD酶始终表现较低活性，见图3。
3.3.2对CAT酶活性影响 各LED光质处理灵芝菌丝体CAT酶活性总体表现逐渐降低趋势。培养至第6天各光质处理菌丝体CAT酶活性均达到最高，大小依次为绿光＞白光＞蓝光＞黑暗对照＞黄光＞红光，见图4。第8天白光处理菌丝体CAT酶活性显著高于其他处理及黑暗对照。红光处理灵芝菌丝体生长前期CAT酶表现较低活性，后期黄光处理CAT酶活性较低。
3.3.3对SOD酶活性影响 灵芝菌丝体SOD酶活性随培养时间延长逐渐升高。黄光处理菌丝体第10天SOD酶活性达到最高且显著高于其他处理及黑暗对照，第12天其酶活性有所下降。其他处理及黑暗对照条件下菌丝体至第12天SOD酶活性达到顶峰，第12天黑暗对照条件下灵芝菌丝体SOD酶活性最高，达到104.04U·g－1·min－1，见图5
3.4LED光质对灵芝菌丝体多糖含量影响
不同LED光质处理灵芝菌丝体多糖含量达到最大值的时间不同。绿光处理第8天菌丝体多糖含量达到最大，显著高于其他处理及黑暗对照。蓝光处理第10天菌丝体含量最高且显著高于其他处理及黑暗对照。黑暗对照条件下菌丝体多糖含量始终保持较低水平，见表1。
4讨论
研究发现，蓝光处理和黑暗对照条件下灵芝菌丝体生长较快，黑暗对照条件下菌丝体形态呈螺旋状、菌落淡薄，生物量积累较慢。白光和蓝光处理灵芝菌落浓密，菌丝体生长粗壮呈匍匐状且生物量积累较快，其中白光处理生物量积累最快。可见，混合光照射灵芝菌丝体生长可加快其生物量积累。不同光质处理灵芝菌丝体多糖含量最高值出现的时间不同，综合分析蓝光利于灵芝菌丝体多糖合成。
POD，CAT，SOD是生物体内主要保护酶类，有清除自由基，维持膜系统完整性，减轻不良环境对生物伤害等作用。研究表明，不同光质处理灵芝菌丝体POD，CAT酶活性高峰分别出现在第6天和第8天，结合菌丝体生长速度和生物量积累分析，此时期正值菌丝体生长高峰。这与文献报道［10-11］，愈伤组织POD，CAT活性最高值标志其生长高峰到来的观点基本一致。绿光在灵芝菌丝体生长中后期POD酶活性保持较高水平，说明绿光对菌丝体生长形成逆境。第6天不同光质处理菌丝体CAT酶活均达到最高值，白光处理菌丝体CAT酶活始终高于其他处理和黑暗对照，表明白光下菌丝体过早老化。灵芝菌丝体生长过程中SOD酶活性随培养时间延长逐渐升高，与植物生长过程中SOD酶活变化出现2个波峰的结论［12］不一致，初步推测是植物与真菌遗传背景和代谢途径差异造成。整个生长过程中黄光处理菌丝体SOD酶始终处于较高水平，表明黄光不利于灵芝菌丝体生长。