上世纪80年代，共聚焦显微技术的发明将激光器带进了生命科学实验室，采用连续波蓝光和绿光氩离子激光器进行细胞结构成像，可以获得传统白光照明方式无法达到的高分辨率。1990年，多光子激发显微（MPE）技术的出现[1]，自然而然地引入了超快激光器，引起了生命科学研究的重大变革。这是由于，首先，美国和欧洲的生物研究经费培育了激光应用技术的快速增长；同时，这些过去比较复杂的激光器的使用者并不是激光专家，这也在促使激光产业界专门设计操作简便、可靠性高的高性能产品。例如，Coherent公司就以“优异超快每一天”的标准推出了一系列产品，以满足生命科学市场的需求。本文将介绍激光技术的创新与生命科学成像是如何互相促进、共同发展的。
图1. 单光子和双光子激发机制对比。
共聚焦显微技术已广为人知，下面将侧重介绍使用输出超短脉冲宽度、高峰值功率的红外激光器，以取代连续波蓝绿光激光器的MPE技术。MPE的基本原理是采用2个或3个红外波段的光子，而不是单个紫外到绿光波段的光子，来激发样品中附着的染料产生荧光（见图1）。大部分染料最初都是为了使用紫外、蓝光或绿光的离子激光器激发设计的，而采用2个甚至3个光子激发就需要MPE激光器的输出波长在700～1000nm范围，也就是钛宝石激光器的输出波段。同时，由于MPE是一个非线性过程，要求激光脉冲具有很短的脉冲宽度以获得很高的峰值功率，至少几十至几百毫瓦的平均功率，以及很高的重复频率（10～100MHz）以获得很快的数据采集速度。那么，脉冲宽度需要多短呢？理想情况下是越短越好，一般在几十飞秒到几皮秒之间。双光子激发下，荧光信号的强度由以下关系式决定：
图2. 水和常见生物组织对激光的吸收。
其中，Pave是到达样品处的激光平均功率，是到达样品处的激光脉冲宽度。由此可见，有两种方法可以增强荧光信号强度――提高平均功率和缩短脉冲宽度。由于荧光强度与平均功率的平方成正比，前一种方法更为有效。
大部分人都认同MPE的主要优点是：既可以获得更深的组织穿透深度，又可以减少激光对细胞结构的损伤。穿透深度的提高是由于采用了红外光激发，可以到达500～800?m深处，比采用蓝绿激光的单光子共聚焦显微技术要深得多。而损伤的减少是由于红外光子能量比UV或蓝绿光子低，也就不容易引起对生物细胞的光化学损伤（见图2）。当然，在焦点位置（像平面）红外光子也有可能引起多光子激发损伤，但由于在焦点以外的区域几乎没有多光子吸收，在整个细胞样品中的总损伤比单光子激发时要小得多。
近几年来，业界对MPE技术、方法、材料和激光光源的研究取得了长足的进展。下面将针对激光光源的选择介绍以下几个领域的进展：
1） 深层组织成像：波长、平均功率和脉冲宽度的影响
2） 提高样品活性
3） 新型成像技术
图3. Chameleon和Chameleon OPO的输出功率和调谐范围。
深层组织成像
虽然水对波长大于500nm的光吸收随波长的增加而增强，但由于血液、黑色素及表皮等对波长大于1000nm（1?m）的光吸收随波长的增加而减弱（见图2），因此波长在1.1～1.35?m范围的激光在很多组织中的穿透深度最深。由于钛宝石激光器的调谐范围最多只能达到1080nm，使用钛宝石激光器泵浦的光参量振荡器（OPO）是将调谐范围扩展到1.5?m的最佳方法。例如，采用Chameleon OPO可以将Chameleon的调谐范围扩展到1～1.5?m，同时只需要很少的用户调节。高功率钛宝石激光器如Chameleon Ultra II与Chameleon OPO配合使用，可以在整个调谐范围中提供足够的激发功率（见图3）。
另外一种提高穿透深度的方法是使用脉冲能量更高（微焦耳量级）、重复频率较低（100～200kHz）的激光器。Beaurepaire [2]和Denk [3]分别在2001年和2002年对此进行了模拟计算和实验验证。两个研究组都使用了Coherent公司的RegA 9000再生放大器，其中Denk在老鼠活脑细胞中获得了1mm的惊人穿透深度。
同时，研究人员也试图通过缩短到达样品处的脉冲宽度来提高荧光信号强度。激光器输出的超短（<1ps）脉冲通过显微镜物镜和光调制器时都会受到“群速度色散”（GVD）的影响，例如150fs的脉冲到达样品后会被展宽到250～350fs，更短的脉冲（如50fs）甚至会被展宽到1ps以上。Coherent公司的Chameleon设计为产生140fs的脉宽输出，因为具有这个脉宽的激光在大多数显微镜系统中只会受到很小的展宽。如果想要减小GVD的影响，可以采用预补偿技术，就是在激光脉冲传输到显微镜系统之前引入负色散，以抵消系统中的正色散。专门为MPE应用设计的高功率激光器（Chameleon Ultra系列）与预补偿技术（Chameleon PreComp）相结合，使现在的MPE研究者可以同时拥有高平均功率和短脉冲宽度，以获得最佳的荧光信号。
最近，Dantus教授的研究组[4]使用输出脉宽10fs、带宽100nm的超快激光器，以获得更强的荧光信号。脉宽10fs的激光脉冲具有100nm的带宽，从而不仅需要进行GVD预补偿，还需要对脉冲进行相位和强度整形，以补偿3阶和高阶的色散。这样的实验就需要新一代宽带宽超快激光器（如Coherent的Micra），以及脉冲整形附件（如Coherent的Silhouette）。
最后需要强调的是，无论是通过提高平均功率还是采用缩短脉冲宽度的方法来获得更深层的组织成像，损伤活体样品的风险是相同的，因为只有让染料通过双光子或者三光子过程吸收更多能量才能获得更强的荧光信号，而很强的激发就有可能导致光损伤。另外，使用更长的激发波长可以在增加穿透深度的同时提高细胞活性。
样品活性
自从上世纪90年代成功地将荧光蛋白（如GFP）附着在活细胞上以来，人们逐渐认识到MPE中降低生物样品损伤的重要性。同传统染料相比，使用可可以发出各种颜色荧光的蛋白质可以显著提高细胞活性。继最早应用的绿色和蓝绿色荧光蛋白之后，科学家又分离和创造出很多种不同的荧光蛋白，目前的发展趋势是使用黄光和红光波段的蛋白[5]，因为它们不仅能扩充成像的色彩种类，而且可以采用更长的激发波长（> 1000nm），有利于深层组织成像。
对细胞损伤的量化评估并不容易。实验证明[6]，在其他所有条件相同的前提下，采用波长1250nm的飞秒激光脉冲激发，所导致的细胞损伤比采用波长800nm激发要小得多（见图4）。两三年以前，产生长波长的激光和获得长波长的荧光蛋白都很困难；而现在可以轻松获得1080nm（如Chameleon Ultra II）甚至1500nm（如Chameleon OPO）的波长，以及Ds Red、mcherry等长波长荧光蛋白的出现，使得MPE技术穿透深度深和样品活性高的优势可以充分发挥。相信这一趋势会继续发展，并出现更长的激发波长和更多种类的蛋白和染料。
图4. 细胞损伤与激发波长的关系（▲代表1250nm激光激发，代表800nm激发，脉冲宽度和平均功率相同）。
新型成像技术
为了进一步降低样品损伤，更为激进的方式就是不采用任何荧光标志物，而利用样品的本征荧光或者其他非线性效应成像。其中最常用的技术有二倍频（SHG）、三倍频（THG）和相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）显微技术。
SHG和THG显微技术可以采用与MPE实验相同的激光器和显微镜，当然激光器、显微镜和探测器的工作波段必须符合要求。在SHG和THG显微中，对比度来自于超快激光激发下不同生物结构的SHG和THG强度的差异。例如，胶原蛋白或者任何的细胞界面都可以产生可测量的SHG信号；微米尺度以下的细胞内含物或者界面上都可以产生THG信号。THG显微已被成功应用于活胚胎的无损成像[7]。SHG显微中，信号频率是激光频率的两倍，即波长是激光波长的一半；THG显微中，信号频率则是激光频率的三倍，即波长是激光波长的三分之一。举例来说，采用1.2?m波长的激光激发，SHG显微信号波长是600nm，而THG显微信号波长是400nm。SHG和THG显微对激发波长没有限制，因此可以自由选择激发波长以同时获得强信号和弱损伤，例如采用1?m以上的红外波长激发，而仍然在可见波段探测。THG显微是三光子激发过程，同双光子激发的SHG显微或MPE相比，需要更高的激光功率。Coherent公司的OPO产品已经被用于多个THG显微实验。
图5. CARS中的四波混频（p为泵浦光，s为斯托克斯光，as为反斯托克斯光，R为分子的特征拉曼位移）
CARS是一个四波混频过程，需要使用两台波长不同而完全同步的激光器产生三束激光，其中两束波长相同，称为“泵浦光”，第三束称为“斯托克斯光”，在它们的共同作用下获得第四束信号光，即反斯托克斯光[8]（见图5）。泵浦光和斯托克斯光的频率差必须精确调节，以产生样品分子的特征反斯托克斯信号，使包含该分子的细胞结构在显微镜下成更亮的像。由于没有使用任何染色剂，采用CARS显微可以比MPE显微研究更多的活细胞分子特性。CARS显微已被广泛应用于脂类成像，而且原则上只要激光波长调谐的范围允许，可以应用于各种样品。CARS显微一般采用皮秒激光而不是飞秒激光，因为CARS跃迁的线宽仅有不到一个纳米，与皮秒激光脉冲的光谱带宽相匹配。最常见的CARS显微系统使用一台1064nm的皮秒激光器及其泵浦的OPO，或者采用两台OPO的信号光和闲置光输出。然而，CARS和其他四波混频技术（如受激参量发射显微[8]）也可以采用超宽带宽的飞秒激光器（如Coherent公司的Micra），以及脉冲整形器，以选择宽带宽中同一波段的两个分立波长产生非线性信号。采用这种方法只需要一台激光器就可以产生两个甚至更多波长来激发样品，大大简化了激光器系统的复杂性。虽然CARS与MPE显微采用的激光器系统不同，但MPE显微镜可以改造为适用于CARS显微的样式。
综上所述，过去的15年来，多种非线性光学技术被应用于生命科学研究。其中，MPE技术最为成熟，也已经被广泛使用。激光器制造商开发出专用的尖端超快激光器，如Coherent公司的Chameleon，以适应和推动MPE技术的进步。同时，其他非线性光学技术的发展也进一步扩展了MPE的优势，并获得了新的分析能力。